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上周，“袁来云云”专栏就药物开发历程中怎样缓解或消除对LBA定量剖析要领滋扰的战略睁开了详细先容(袁来云云｜大分子生物剖析概论（六）上：LBA定量抗体药物的配景滋扰及其消除)，本期将延续上期内容，重点关注抗体生物药的定量剖析 。
“袁来云云”专栏系广州永乐国际医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为永乐国际医药子公司深圳博瑞副总司理袁智博士原创 。
LBA测试要领常用于定量生物基质中抗体药物的浓度，凭证测试名堂的差别，LBA可以测定游离药物的浓度或药物总量 。游离药物是指不与靶点团结的治疗性抗体 。药物总量则指游离的加上团结了靶标的药物 。由于PK数据至关主要，相关羁系指南和行业共识都对定量要领的验证提出了相关建议，包括应对滋扰的一些方面 。
游离的抗体药物的测定通常使用抗原或中和性抗奇异型抗体(anti-ID)作为捕获抗体 。检测抗体可以是中和性anti-ID、非中和性anti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗体（如抗人IgG2特异性抗体）或抗药物抗体的框架突变（anti-framework mutations）的抗体 �？固逡┪镒芰靠杀环侵泻托詀nti-ID、抗人IgG、抗人特定等型（specific isotype）抗体或抗药物抗体的框架突变的抗体捕获和检测 。可是，很少能获得非中和性anti-IDs，由于在大大都情形下，生产anti-IDs时会爆发许多中和性anti-IDs，但非中和性anti-IDs的爆发量却很少 。
游离抗体药物的定量在手艺上是具有挑战性的，特殊是当可溶性靶标在样本中处于高水平时，许多基质因素可以显著改变可溶性靶标的水平或影响药物与可溶性靶标的团结，从而引起游离药物浓度的转变 。别的，这些因素也很有可能对之前所讨论的可溶性靶标定量起到滋扰 。
在定量剖析抗体-药物偶联物(ADCs)时，样本的制备具有特殊意义，由于ADCs可以在收罗的样本中或体内爆发生物转化，使本已重大的ADC生物剖析越发重大化 。
纵然是单克隆抗体的定量也会受到样本制备要领的影响 。例如，使用EDTA作为抗凝剂会螯合阳离子（如Ca2+和Mg2+），从而影响游离抗体药物浓度的准确测定，若是这些阳离子是药物与靶标团结所必需的 。
在样本网络和制备历程中，不睬想的程序（如上半篇提到的生物标记物部分所讨论的）会从细胞中释放可溶性靶标，导致样本中靶标的浓度人为地升高，从而低估了游离抗体的浓度 。
为了镌汰这些潜在的滋扰，在对每个抗体药物举行剖析时，都应该优化样本收罗程序和检测条件 。正如前文所提到的，制备血清的历程可释放贮保存血小板中的卵白质，而使用血浆则可阻止它的释放 。别的，可以实验样本增稳的条件，如低温，可以镌汰在样本网络历程中卵白质从细胞中释放出来的量 。在检测试剂保存的情形下先举行样本酸解处置惩罚，再举行中和处置惩罚，或在检测历程中坚持样本的弱酸性，该要领已被证实可以有用地镌汰来自靶标的滋扰 。
关于游离抗体药物的剖析，应该优化检测条件，如孵育时间、捕获试剂的浓度和最低稀释要求，以最大限度地镌汰药物从它的靶标解离 。这对与其靶标亲和力较低、在血液循环中可溶性靶标浓度较高的抗体药物，尤为主要 。因此，需要在研究人群中评估稀释线性度和样本稳固性，以将靶标水平的转变对游离药物定量的准确性这一影响纳入思量 。
当使用抗原捕获待测物时，高浓度的团结卵白或可溶性受体（soluble receptor）可能会饱和捕获试剂，致使游离药物的浓度被低估 。使用中和性anti-ID，而不是药物靶标，作为捕获试剂，则可以最大限度的镌汰这个问题 。
样本中的ADA是基质滋扰的一个泉源 。ADA与捕获抗体（或在均相测试要领中的检测抗体），团结到抗体药物上，这一竞争会低估抗体药物的浓度；非竞争性ADA可使抗体药物分子交联形成概略量的复合物，这也会影响药物浓度测定的准确性 。通过对PK、PD和ADA的效果举行较量，可以验证研究中是否保存这种滋扰，从而响应地诠释相关数据 。
与生物标记物测定相似，基质中的heterophilic抗体和人抗动物抗体是免疫测试中的常见滋扰泉源，可以用前述相同的要领来减轻滋扰的影响 。若是使用抗人抗体作为捕获或检测试剂，人体基质中的人体免疫球卵白可导致显著的配景信号，可以选择使用Isotype-specific anti-human antibody替换pan anti-human antibody，以镌汰滋扰 。
生物药和完全的人源抗体药都有可能爆发ADA（也称为抗药物抗体），会导致药物袒露量的损失、药效损失和严重的不良反应 。免疫原性评估是临床研究中清静性评估的主要组成部分，ADA通常接纳分级要领举行检测（筛查）、确认和表征 。ADA测定是半定量的，由于这些测试要领缺乏标准曲线 。阳性的界说是在测试切点以上的检测信号，由未接受药物的阴性样本的统计剖析确定 。
针对抗体药ADA的测定也主要是通过LBA要领举行的 。大大都ADA免疫剖析接纳桥接测试名堂，即ADA桥接（bridge）/交联（crosslink）两个药物分子团结 。对抗体药中使用较少的另一种要领是直接团结免疫测试（direct binding immunoassays），其中抗体药是捕获试剂，检测试剂则是检测ADA的Fc部分 。
在ADA检测中最常见的滋扰是抗体药自己，样本中的药物与ADA团结，避免ADA与测试试剂形成复合物，在药物保存的情形下检测到ADA的能力，称为药物耐药性 。
在临床和非临床ADA试验要领验证历程中，羁系机构会要求评估和扫除这样的滋扰，可以通过在药物浓度预期较低的时间点（drug wash-out phase）网络样本举行ADA测试来缓解药物滋扰 。在某些情形下，通过酸疏散可以提高药物耐受性 。
（1）使用酸解离药物-ADA复合物；
(2)在检测试剂的保存的情形下中和样本；
(3)举行测试
使用高迅速度的剖析要领和稀释样本是提高耐药性的有用要领，用药物捕获ADA并通过Fc区域检测ADA的直接团结式LBA要领可能较少受到药物滋扰，在这种要领中，只要ADA的一端可与药物捕获团结，就能检测到ADA 。
桥接的测试名堂则要求ADA的两头团结到测试试剂，Wu等人形貌了一个直接团结式，以检测药物特异性的ADAs（IgE等型），并通过萃取抗体量总量，进而检测copurified 药物来定量ADA，这样可以完全消除药物滋扰 。Neubert等人通过protein G extraction，然后使用LC-MS检测copurified药物，证实晰此要领的可行性 。表1 枚举了一些用于破损ADA-药物复合物，以提高ADA检测迅速度的要领（详见扩展阅读#2） 。限于篇幅，本文不详细逐一讨论，请参阅本文末的参考文献 。
样本基质中的药物靶标也可能滋扰ADA检测，导致假阳性或阴性效果，桥接捕获和检测试剂的multimeric可溶性靶标能够爆发假阳性效果 。有报道称，在ADA测试中，含有CD20的细胞膜片断会对atumumab爆发基质滋扰，阴性效果可能是由于可溶性靶标与捕获和/或检测抗体团结，从而阻断中和性ADA的检测 。下面的样本预处置惩罚，即用阻断性抗体团结靶标，或用团结卵白对靶标举行阻断以及免疫消耗靶标，都可以消除这种滋扰 。例如，在针对ranibizumab的ADA要领开发历程中获得了证实 。
虽然，大大都学者以为未使用生物药的小我私家不会有ADA，但有时在给药前就会检测到先前保存的抗体 。值得一提的是，先前保存的抗体并不是滋扰，且可能团结到抗体药物的任何地方 。例如，检测到并确认了对panitumumab的中和性ADA，但报道说这些交织反应性抗体并未改变药物PK或其清静性 。
只管云云，先前的ADA总是使得测试和效果诠释变得更重大 。滴度和特异性测试有助于相识先前保存的抗体对给药后ADA爆发率的孝顺，针对cetuximab的先前保存的抗体有临床相关性，即先前保存的IgE抗体与严重的超敏反应有关 。当一个抗体药物含有某个自然卵白的免疫原性结构域并且大大都人以前可能接触到该结构域时，就很可能会有预先保存的ADAs 。在recombinant therapeutic immunotoxins，即anti-CD3-diptheria toxin 和anti-CD22 Pseudomonas exotoxin A的临床研究中，就视察到先前保存的ADA 。
表1. 用于破损ADA-药物复合物，以提高ADA检测迅速度的要领
在类风湿枢纽炎患者中较为常见的类风湿因子(rheumatoid factor，RF)，它是针对IgG的Fc区域的抗体，主要为IgM等型抗体 。RF的团结亲和力低，预期不会在ADA测试中爆发阳性信号，然而工程刷新过的抗体药物可能对RF有更高的亲和力，从而可能在ADA检测中爆发阳性信号 。Araujo等人证实，在给药前的样本中，RF爆发了阳性信号，而使用抗人IgM抗体的样本预处置惩罚会镌汰RF的作用 。这种要领可能会影响IgM等型的ADA检测，作者筛查了含有和不含有抗IgM抗体的样本，并监测药物治疗时代滴度的增添 。
可溶性卵白生物标记物、治疗性抗体和ADA的生物剖析是药物开发中不可支解的一部分，每一种剖析物都有其自身的挑战 。阻止基质滋扰最有用的要领是对靶标生物学和待测物自己具有扎实的理论基础，并着重关注测试/剖析要领的特异性 。
剖析手艺也可能在避免或减轻测试滋扰方面施展主要作用 。在许多情形下，稀释是镌汰滋扰的有用工具，而最高的稀释倍数受到检测迅速度的限制 。高迅速度的剖析平台在高稀释条件下，可以提供有用的工具，以只管镌汰来自基质的滋扰，疏散和纯化手艺的刷新可以有用地将待测物从滋扰因子中疏散出来 。例如，在ADA剖析中，有用地从抗体药物-ADA复合物中定量疏散出ADA就能解决其药物耐受性问题 。
MS与LC团结已经成为一种强盛的定量要领，并且越来越多的应用在卵白药物 (尤其是抗体药物偶联物)和生物标记物的生物剖析上 。与LBA要领相较量，滋扰对它的似乎不那么主要，由于MS是特异性很强的剖析要领 。虽然剖析特异性在完全消除滋扰方面会很是有资助，但若是待测物在生物学上是完全等同的（identical），它也可能使生物剖析变得极其重大 。
在许多情形下，MS能够检测许多差别待测物的混淆物，而LBA要领只能检测一种待测物 。因此，LC-MS/MS在生物剖析中施展越来越主要的作用 。本系列后续文章将先容大分子生物剖析中LC-MS/MS要领 。敬请关注 。
本文若有疏漏和误读相关指南和数据的地方，请读者谈论和指正 。所有引用的原始信息和资料均来自已经揭晓学术期刊, 官方网络报道, 等果真渠道, 不涉及任何保密信息 。参考文献的选择思量到多样化但也不可能完整 �＝哟琳咛峁┯屑壑档奈南准捌淦拦� 。
1. Schwickart M, et al. Interference in immunoassays to support therapeutic antibody development in preclinical and clinical studies. Bioanalysis (2014) 6(14), 1939–1951
2. DeSilva B, et al. Recommendations for the bioanalytical method validation of ligand-binding assays to support pharmacokinetic assessments of macromolecules. Pharm Res. 2003;20(11):1885–900.
3. Kroll MH, Elin RJ. Interference with clinical laboratory analyses. Clin. Chem. 40(11 Pt 1), 1996–2005 (1994).
4. Tate J, Ward G. Interferences in immunoassay. Clin. Biochem. Rev. 25(2), 105–120 (2004).
5. Weber TH, et al. Endogenous interference in immunoassays in clinical chemistry. A review. Scand. J. Clin. Lab. Invest. Suppl. 201, 77–82 (1990).
6. Levinson SS, et al. Towards a better understanding of heterophile (and the like) antibody interference with modern immunoassays. Clin. Chim. Acta 325(1–2), 1–15 (2002).
7. Kricka LJ. Human anti-animal antibody interferences in immunological assays. Clin. Chem. 45(7), 942–956 (1999).
8. Bolstad N, et al. Heterophilic antibody interference in commercial immunoassays; a screening study using paired native and pre-blocked sera. Clin. Chem. Lab.Med. 49(12), 2001–2006 (2011).
9. Stevenson LF, et al. Parallelism: considerations for the development, validation and implementation of PK and biomarker ligand-binding assays. Bioanalysis 6(2),185–198 (2014).
10. Lee JW, et al. Fit-for-purpose method development and validation for successful biomarker measurement. Pharm. Res. 23(2), 312–328 (2006).
11. Emerson JF, et al. Screening for interference in immunoassays. Clin. Chem. 49(7), 1163–1169 (2003).
12. Dimeski G. Interference testing. Clin. Biochem. Rev. 29(Suppl. 1), S43–S48 (2008).
13. Muller W, et al. Interference of IgM rheumatoid factor with nephelometric C-reactive protein determinations. J. Immunol. Methods 80(1), 77–90 (1985).
14. Kelly MM, et al. Increased detection of interleukin-5 in sputum by addition of protease inhibitors. Eur. Respir. J. 18(4), 685–691 (2001).
15. Salimi-Moosavi H, et al. Novel approaches using alkaline or acid/guanidine treatment to eliminate therapeutic antibody interference in the measurement of total target ligand. J. Pharm. Biomed. Anal.51(5), 1128–1133 (2010).
16. DeSilva B, et al. 2012 white paper on recent issues in bioanalysis and alignment of multiple guidelines. Bioanalysis 4(18), 2213–2226 (2012).
17. Partridge MA, et al. Minimizing target interference in PK immunoassays: new approaches for low pH-sample treatment. Bioanalysis 5(15), 1897–1910 (2013).
18. Verch T, et al. Pharmacokinetic immunoassay methods in the presence of soluble target. J. Immunol. Methods 361(1–2), 75–81 (2010).
19. Koren E, et al. Recommendations on risk-based strategies for detection and characterization of antibodies against biotechnology products. J. Immunol. Methods 333(1–2), 1–9 (2008).
20. Stubenrauch K, et al. Generic anti-drug antibody assay with drug tolerance in serum samples from mice exposed to human antibodies. Anal.Biochem. 430(2), 193–199 (2012).
21. Patton A, et al. An acid dissociation bridging ELISA for detection of antibodies directed against therapeutic proteins in the presence of antigen. J. Immunol. Methods 304(1–2), 189–195 (2005).
22. Zhong ZD, et al. Identification and inhibition of drug target interference in immunogenicity assays. J. Immunol. Methods 355(1–2), 21–28 (2010).
23. Xue L, Rup B. Evaluation of pre-existing antibody presence as a risk factor for post-treatment anti-drug antibody induction: analysis of human clinical study data for multiple biotherapeutics. AAPS J. 15(3), 893–896 (2013).
24. Chung CH, et al. Cetuximab induced anaphylaxis and IgE specific for galactose-alpha-1,3-galactose. N. Engl. J. Med. 358(11), 1109–1117 (2008).
25. Kelley, M, et al., Theoretical considerations and practical approaches to address the effect of anti-drug antibody (ADA) on quantification of biotherapeutics in circulation. AAPS J, 2013. 15(3): p. 646-58.
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