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此前，“袁来云云”专栏就抗体药物和靶标生物剖析数据的详细应用以及mAb和L的团结可能爆发的问题睁开了详细介绍(袁来云云｜大分子生物剖析概论（七_）上：LBA测定抗体药物与其靶标的总/游离浓度)，本期将延续上期内容，重点关注抗体药物的定量和靶配体的生物剖析要领。
“袁来云云”专栏系广州永乐国际医药微信公众号打造的科普学术专栏，内容均为永乐国际医药子公司深圳博瑞副总司理袁智博士原创。
虽然可以设计LBA用来丈量mAbfree或mAbtotal，但受试剂限制、样本稀释等影响，并不可确定该要领是否仅仅测定mAbfree。因此，可以接纳测定mAbtotal的战略。mAbtotal和mAbfree的剖析要领见表6，典范的ELISA检测名堂见图2。
由于特异性试剂通常是不可及的，以是在临床前阶段通常接纳测定mAbtotal的“通用”剖析要领。为了与试验物种IgGs的交织反应最小化，可以使用抗轻链（anti-light-chain）和/或亚型特异性（subclass-specific）试剂（例如图2的a、b使用抗Fc试剂）。同样的要领可以用于多种动物和差别的候选药物，可是关于每个物种，仍然需要验证每个mAb要领。
“通用”剖析要领可以作为一种“现成的（off-the-shelf）”要领使用，在早期开发中，仅需要很少的优化（在确定特定的测试试剂之前）。然而，这种名堂的剖析要领不适用于临床样本的检测，由于其中含有mg/mL级别的人体内源性IgG的滋扰，需要外加待测物，接纳实验评价来确认无内源性组分的滋扰。别的，该要领对活性（active）mAb药物没有特异性，但可能会与变性了的（denatured）、化学或卵白酶降解后的mAb爆发反应。
互补配对的名堂使用的非抑制性抗CDR抗体试剂（抗体试剂识别mAb超可变区域上不加入L团结位点的抗原表位）和通用试剂要领是一种可以用于临床样本的检测要领（例如,图2a使用anti-mAb试剂）。在临床样本中，这种互补决议区域(complementarity-determining regions，CDR)的抗原表位不会泛起在内源性人类IgG上。可是却很难获得这样的non-inhibitory anti-CDR mAb试剂。另外，若是使用多克隆抗体试剂，在药物开发项目的生命周期中，维护试剂批次间的一致性也是一个挑战。
对特异于mAbfree的测试名堂，一对试剂中至少有一个试剂必需与待测物的统一位点团结。这些试剂可能是与L竞争团结的anti-idiotypic抗体（即inhibitory anti-ids）或者是L自己（图2c， d）。这种剖析方法的一个变种源自试剂的组合应用（例如，“桥接bridging”名堂中，使用相同的试剂捕获和检测mAb，L作为捕获试剂，与anti-idiotypic抗体举行团结检测，反之亦然）。桥接名堂的一个优点是为了能够被检测到，mAb必需要有两个functionally free团结位点。使用L的捕获方法要求mAb只有一个供检测的游离团结位点，并且对游离和部分游离的药物都有特异性。但剖析效果并没有展现这两种形式的相比照例。
在mAbfree的竞争式剖析名堂中，标记的mAb（例如biotin或horseradish peroxidase标记的）允许与样本中未标记的mAb竞争，以团结特定的捕获试剂。标记的mAb的数目将与样本中mAb的数目成反比。可是竞争式要领可能不如非竞争式要领的稳健性好。
虽然mAbfree代表拥有物活性的形式，是药代动力学家们的首选，但现实上，纵然是设计优异的剖析要领，对体内mAbfree浓度的定量也保存着挑战性。正如《团结平衡和对mAbtotal/mAbfree剖析要领的挑战》中所讨论的，样品收罗条件、处置惩罚历程或剖析要领都可以对平衡做出滋扰影响，改变mAbfree的比例。
作为替换要领，样品中mAbfree、Lfree和mAb-L的浓度可由mAbtotal和Ltotal来盘算。可是盘算是以平衡方程为基础的，这需要对体内平衡解离常数（Kd）有很好的估算。由于动态平衡将随着差别的mAb和响应的L浓度而爆发转变，以是需要在保存过量L的情形下检测mAb，然后凭证履历判断它确实是mAbtotal或mAbfree的测试要领。
图3展示了测试L对mAb滋扰的示例。以差别的摩尔比预孵育L和mAb，抵达平衡后，用特定ELISA来测定mAb的浓度。以L/mAb的摩尔比为X轴，抑制率为Y轴绘图。关于mAbfree的测定，IC50将靠近1。但需要注重的是，用于测试的重组L可能不可完全与其内源性形式一样地团结mAbfree，而导致IC50偏离真实值。
别的，选择一致和稳健的剖析要领来支持mAb产品的临床开发也很主要。若是需要改变要领，应同时使用外加药物的样本和真实的研究样本举行要领较量，以确定改变剖析要领对PK数据的影响。
Ltotal展示了有关mAb对L累积的影响的信息。由于mAb的半衰期通常比循环系统中L的半衰期长，给药后形成的mAb-L可能不会像Lfree那样快速扫除。别的，在某些情形下，作为给药后的响应，膜受体形式中L表达的上调或可溶性L的合成可能增添血液循环中L的浓度。
用于Ltotal的剖析要领有多种。表7枚举了相关要领并总结了这些要领的应用和局限性。
在给药历程中，监测Lfree对确定有用剂量具有主要意义。试剂的选择对Lfree剖析的影响与对mAbfree相似，但越发重大。在许多情形下，与膜团结的L相比，组织中的可溶性L含量较低，可能需要高迅速度的剖析要领来测定Lfree的正常水平。在大大都情形下，mAb/L的高摩尔比对给药后Lfree定量剖析的准确度造成了一定的阻碍。但即便云云，仍可获得Lfree的相对趋势，以提供有关mAb的影响和维持所需的Lfree水一律有价值的信息。
表8总结了临床前和临床阶段用于测定Lfree的要领，图5展示了典范的测定Lfree的剖析要领。特异性的抑制性抗L抗体或mAb（或mAb模拟物）可作为捕获试剂，而特异性的非抑制性抗L抗体可作为检测试剂（图5a）。可是解离团结形式的L（bound form of L）的样本处置惩罚办法和剖析条件可能会导致检测值偏高(见《团结平衡和总/游离型剖析的挑战》)。
另一种要领是通太过子筛、固相萃取或亲和疏散法，在LBA剖析之前，去除团结形式的L(图5b，如使用G卵白、A卵白或抗人FC柱)。然而，由于柱子或过滤器外貌的吸附作用，这些特另外办法可能会带来误差，并且在这些疏散历程中也可能会爆发解离。因此，Lfree的数据只能显示出相对的趋势，而不可作为绝对的定量效果。
在使用样本制备要领开发Ltotal和Lfree测定要领的时间，需要重点评估在预期浓度规模内的Lrecovery（L的接纳率）以及在预期有或没有mAb的基质中，评估来自样本基质和其它相关团结卵白的滋扰。主要的是要确认在使用最终要领时测定的值是Ltotal照旧Lfree� ？梢越幽刹畋餸Ab/L摩尔比举行滋扰测试，类似于图3所示的实验。
测定靶标配体 (Ltotal或者Lfree)可以提供一些主要的信息，包括证实mAb与L的体内团结、靶点占用率、有用的mAb浓度以及PK/PD关系。
测定L的准确度取决于标准参照（比）物和试剂的质量。当不可获得内源性L的标准参照（比）物时，可以使用重组或合成的L标准参照（比）物。定量的准确度取决于标准参照（比）物与内源性待测物这二者与测试试剂团结的相对活性（relative binding activity）。
在剖析要领验证的历程中，应评估Ltotal的平行性，以确定该要领是否能像标准参照（比）物一样识别内源性的L。若是缺乏平行性数据，该剖析要领只能是半定量的，所爆发的数据必需在此配景下举行诠释。当没有足够高浓度的内源性L样原来评估平行性时，诠释数据时应该审慎使用绝对浓度这样的术语。在这种情形下，L的相对转变趋势将越发可靠。
为了适外地使用息争释生物剖析数据，相识数据的可靠性和局限性是至关主要的。在LBA要领中，捕获和检测试剂是决议该要领的特异性（针对游离的、团结的或总浓度的特异性）的要害组成因素。明确mAb/L的比值和动态平衡关于选择最合适的名堂举行要领开发是至关主要的。
别的，在疾病模子或特定患者群体中，靶标配体的状态可能与康健比照群体有着很是差别的情形，以是相识在差别物种和疾病状态中泛起的mAb/L比值的可变性也很主要。纵然拥有高度表征的试剂，也应该明确mAb-L在体内是以动态平衡的方法保存的，因此体外（ex vivo）的测试条件（例如样本稀释和孵育时间）会影响mAb和L的定量以及它们两者之间的平衡，可以通过研究mAb-L平衡，剖析操作办法，评估实验效果，来判断它们是否真实反应了研究样本中的团结关系（binding relationships）。本文的表格中所列出的样品处置惩罚战略和定量要领，经常适用于要领开发，其目的是定量剖析游离（free）的、总体（total）的和团结了（bound）的mAb和L的种种形式。
mAb和L的浓度数据一样平常用来在药物开发的差别阶段资助做出详细的决议。在临床前研究中，可能没有相关试剂用于开发定量mAbfree的要领。mAbfree和mAbtotal（当没有检测mAbfree的要领时）的定量数据将用于评估系统袒露量-时间历程与毒性研究效果的关系，并展望人体起始剂量的清静余量。通常情形下，mAb给药的剂量会使得血液中mAb的浓度远超L，因而mAbtotal与mAbfree相近并可以作为mAb活性的指标，进而基于PK-PD模子盘算来决议接纳多大剂量。
在临床评估中，会使用特定试剂测定mAbfree或mAbtotal以形貌mAb药物在人体中的漫衍情形，并将mAb的袒露量与其清静性和有用性联系起来。同时，也有助于更好地明确mAb-L的动力学，为后期临床研究时选择给药计划提供相关信息。
在药物开发中，越来越多的研究职员选择使用靶标配体（L）的浓度数据来指导决议。例如，Lfree的数据可用于指导给药剂量和频率的选择。对L动力学的明确有助于确定维持受体占用率所需的mAbfree的有用浓度。在许多情形下，由于Lfree的浓度很低，并且可能随剖析条件的转变而转变，定量数据可能是不可靠的。
另一种要领是考察给药后Lfree的转变趋势，而不是依赖其绝对值。Ltotal提供了mAb活性的证据，别的，若是mAb–L的团结改变了靶点表达量(例如L的高度积累)，可能需要提醒研究职员注重清静性的问题。可以在PK/PD模子中，使用Ltotal来推断Lfree的浓度。凭证Ltotal、Lfree以及mAbfree或者mAbtotal的适当信息，通过PK/PD建模来预计Lfree的体内团结亲和力和抑制作用，这可能有助于给药剂量和频率的选择。
由于待测物的形态(游离/总/复合，free/total/complex)和用于定量这些形态的生物剖析要体会影响药物袒露量-时间历程简直定，因此在整个药物开发妄想的配景下，对生物剖析数据的诠释坚持一致是至关主要的。
别的，设计能够解决相关科学问题的生物剖析要领也很主要。由于每个靶标及其相关疾病生物学的重大性和奇异性，应与数据的最终用户协商，为每个药物开发项目全心制制定量相关形式的生物剖析战略，并思量药物靶标生物学、药物开发阶段和包括试剂可及性在内的现实挑战。目今知足所有要求且令人知足的生物剖析要领少之又少，还需要更多的起劲来开发相关要领，以是现在大大都情形下只能使用不太理想的剖析要领来支持药物开发的某个阶段。在这种情形下，应该清晰地向所有利益攸关方转达使用不太理想的剖析要领时的注重事项、对数据的影响和项目的相关危害，以确保做出适当的决议。
在一些文献中，有些学者使用串联高效色谱-质谱(LC-MS/MS)要领来定量mAb。此种要领涉及酶消化，将mAb转化成小的肽段（以坚持在一定的质荷比规模内）。需要注重的是，mAb必需在酶消化前变性，确保mAb与L的疏散。因此，LC-MS/MS要领可用于定量mAbtotal。用于卵白质定量的LC-MS/MS要领将在后续文章中探讨。
虽然本文所述的问题和例子可适用于多种类型的生物药，但为了明确起见，本文重点关注的是mAb及其相关的靶标配体L。关于其它生物药的重大性，如卵白质、肽和寡核苷酸及其相互作用，还需要进一步思量扩展这里提出的看法，并在未来探讨。
就现实的剖析要领开发和效果数据的适当运用而言，提出明确和坚决的建议是一个重大的挑战。本文试图确定在药物开发的每个阶段数据的适用性，以便开发可以用于特定目的的定量剖析要领。更主要的是强调了剖析要领的局限性（关于适外地诠释和使用数据而言）。后续有时机将继续探讨mAbs和非mAbs生物药的相关问题和挑战，如团结mAb的抗药物抗体（ADA），敬请关注。
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